La EN 14675 establece un método cuantitativo de suspensión para evaluar la actividad viricida de antisépticos y desinfectantes químicos utilizados en el área veterinaria. Se trata de un ensayo de fase 2, etapa 1, diseñado para comprobar la eficacia del producto bajo condiciones controladas que simulan determinados aspectos de su utilización práctica.
A diferencia de un ensayo básico de cribado, la EN 14675 incorpora variables como la temperatura, el tiempo de contacto, la presencia de materia orgánica y la concentración del producto. Esto permite evaluar cómo responde el desinfectante cuando se enfrenta a condiciones que pueden reducir su eficacia.
El método utiliza como virus de referencia el Bovine enterovirus Type 1 (ECBO) y establece como criterio principal una reducción del título viral de al menos 4 log₁₀.
Para los laboratorios que realizan ensayos de eficacia biocida, comprender correctamente el método no solo es importante para obtener un resultado conforme. También es fundamental para garantizar la reproducibilidad del ensayo y poder demostrar competencia técnica mediante comparaciones interlaboratorio.
¿Qué Es La EN 14675?
La EN 14675:2015 es la norma europea que establece el ensayo cuantitativo de suspensión para la evaluación de la actividad viricida de antisépticos y desinfectantes químicos utilizados en el área veterinaria.
En España se encuentra adoptada como UNE-EN 14675:2015.
Se trata de un ensayo de fase 2, etapa 1, lo que significa que evalúa la actividad viricida en suspensión bajo condiciones que pretenden aproximarse a determinados aspectos del uso práctico del producto.
En este tipo de ensayos ya se incorporan variables que pueden modificar la eficacia de un desinfectante, como:
- La concentración utilizada.
- La temperatura.
- El tiempo de contacto.
- La presencia de sustancias interferentes.
- El microorganismo utilizado.
- Las condiciones de preparación y dilución del producto.
Esto diferencia la EN 14675 de los ensayos de fase 1, que tienen un carácter más básico y no están vinculados a un área específica de aplicación.
Si quieres conocer mejor cómo se estructuran las diferentes fases de evaluación de los desinfectantes, puedes consultar nuestro artículo sobre procedimientos para demostrar la actividad de productos antisépticos y desinfectantes.
¿A Qué Productos Se Aplica La EN 14675?
La EN 14675 se aplica a antisépticos y desinfectantes químicos destinados al área veterinaria.
Dentro de este ámbito se incluyen productos utilizados durante:
- La cría de animales.
- La ganadería.
- La producción animal.
- El transporte.
- Las instalaciones veterinarias.
- El alojamiento de animales.
- La gestión y eliminación de animales.
La norma no se aplica a los animales una vez que han sido sacrificados y han entrado en la cadena de procesado de alimentos.
Por tanto, es importante no confundir la EN 14675 con las normas destinadas a evaluar actividad viricida en el área médica, alimentaria o industrial.
La elección de la norma debe corresponder siempre con el ámbito de utilización y el claim que se pretende respaldar.
En nuestra guía sobre evaluación de la eficacia de antisépticos y desinfectantes puedes encontrar una visión más amplia de las principales normas europeas según la actividad antimicrobiana y el área de aplicación.
EN 14675 Es Un Ensayo De Fase 2, Etapa 1
La clasificación como fase 2, etapa 1 es importante para interpretar correctamente lo que demuestra el ensayo.
En esta etapa, el producto se enfrenta al virus en una suspensión líquida bajo unas condiciones experimentales definidas.
Esto permite controlar con precisión variables como:
virus + sustancia interferente + concentración del producto + temperatura + tiempo de contacto
El objetivo es determinar si el desinfectante mantiene una actividad viricida suficiente bajo esas condiciones.
Sin embargo, el ensayo no reproduce directamente una superficie, un equipo o una instalación contaminada.
Los ensayos de fase 2, etapa 2 introducen posteriormente condiciones todavía más próximas a determinadas situaciones reales de aplicación.
Por tanto, superar EN 14675 demuestra actividad viricida bajo las condiciones definidas por este ensayo de suspensión, pero el resultado siempre debe interpretarse dentro del alcance concreto del método.
¿Qué Virus Utiliza La EN 14675?
El microorganismo de ensayo obligatorio es:
Bovine enterovirus Type 1 (ECBO), ATCC VR-248.
La norma selecciona este virus como organismo modelo por su resistencia y por su relevancia para el ámbito veterinario.
ECBO pertenece al grupo de los picornavirus, que incluye virus caracterizados por una elevada resistencia frente a determinadas condiciones físicas y químicas.
Entre otras características, estos virus pueden presentar una importante resistencia frente a numerosos productos químicos y no dependen de una envoltura lipídica susceptible de ser destruida fácilmente por determinados desinfectantes.
Por ello, Bovine enterovirus Type 1 proporciona un desafío exigente para evaluar la actividad viricida del producto.
La norma utiliza un virus modelo precisamente porque ensayar todos los virus potencialmente relevantes frente a cada formulación desinfectante sería inviable.
Condiciones Obligatorias Del Ensayo EN 14675
La EN 14675 establece unas condiciones experimentales obligatorias que permiten comparar resultados obtenidos bajo un marco común.
Las condiciones de referencia incluyen:
| Parámetro | Condición |
| Virus De Ensayo | Bovine enterovirus Type 1 (ECBO) |
| Temperatura | 10 °C |
| Tiempo De Contacto | 30 minutos |
| Condición De Suciedad Baja | 3,0 g/l de albúmina bovina |
| Condición De Suciedad Alta | 10 g/l de albúmina bovina + 10 g/l de extracto de levadura |
| Reducción Viricida Requerida | ≥ 4 log₁₀ |
La sustancia interferente utilizada debe seleccionarse teniendo en cuenta las condiciones prácticas de utilización del producto.
Esto es importante porque la presencia de materia orgánica puede modificar significativamente el comportamiento de un desinfectante.
Un producto eficaz en condiciones muy limpias puede mostrar un comportamiento diferente cuando existen proteínas u otros materiales orgánicos capaces de interferir con la acción de sus sustancias activas.
Condiciones Adicionales: Temperatura Y Tiempo De Contacto
La norma permite utilizar condiciones adicionales cuando sea necesario representar otras situaciones de utilización.
Además de los 10 °C obligatorios, pueden ensayarse temperaturas de:
- 4 °C
- 20 °C
- 40 °C
También pueden evaluarse otros tiempos de contacto, como:
- 1 minuto
- 5 minutos
- 60 minutos
Estas condiciones adicionales deben seleccionarse en función del uso práctico que se pretenda respaldar.
Por ejemplo, un producto destinado a utilizarse rápidamente no debería fundamentar sus instrucciones de uso únicamente en un resultado obtenido tras un tiempo de contacto que no pueda respetarse razonablemente durante su aplicación real.
Por eso, la eficacia viricida debe interpretarse siempre junto con la concentración, temperatura, tiempo de contacto y carga orgánica ensayadas.
Concentraciones Del Producto: ¿Por Qué Se Ensayan Varias?
La EN 14675 establece que las soluciones del producto deben prepararse al menos a tres concentraciones diferentes.
El ensayo debe incluir:
- Una concentración dentro del rango activo.
- Una concentración dentro del rango no activo.
- Una o varias concentraciones adicionales que permitan caracterizar adecuadamente la respuesta.
Existe además una particularidad importante.
Durante el ensayo, el producto se mezcla con la suspensión viral y la sustancia interferente, por lo que se produce una dilución.
Como consecuencia, la concentración máxima que puede evaluarse en el ensayo es del 80 %, incluso cuando se parte del producto tal como se comercializa.
Para los productos concentrados, las diluciones se preparan normalmente utilizando agua dura.
En los productos listos para usar, se utiliza agua según las condiciones establecidas por el método.
Cómo Se Realiza El Ensayo EN 14675
El principio del ensayo consiste en poner en contacto una suspensión viral con el producto desinfectante bajo condiciones controladas.
De forma simplificada, el proceso sigue estas etapas.
1. Preparación De La Suspensión Viral
Se prepara una suspensión de Bovine enterovirus Type 1 (ECBO) con un título suficientemente elevado para poder demostrar posteriormente una reducción de al menos 4 log₁₀.
El virus se multiplica utilizando una línea celular apropiada.
La norma contempla la utilización de células MDBK, aunque pueden emplearse otras líneas celulares si se demuestra que ofrecen resultados equivalentes.
2. Incorporación De La Sustancia Interferente
La suspensión viral se mezcla con la sustancia interferente correspondiente.
Esta etapa permite reproducir la presencia de materia orgánica que puede existir durante la utilización práctica del desinfectante.
Dependiendo de la aplicación prevista, se emplearán las condiciones de suciedad baja o alta establecidas por la norma.
3. Adición Del Producto Desinfectante
Después se añade el producto desinfectante a la mezcla.
La combinación se mantiene durante el tiempo de contacto y a la temperatura establecidos.
En las condiciones obligatorias, el ensayo se realiza a 10 °C durante 30 minutos.
4. Detención De La Actividad Del Producto
Una vez finalizado el tiempo de contacto, la acción del desinfectante debe detenerse inmediatamente.
En el procedimiento descrito por EN 14675 esto puede realizarse mediante una dilución rápida en medio de cultivo frío, seguida de las correspondientes diluciones seriadas.
Cuando la actividad del producto no pueda detenerse adecuadamente mediante esta estrategia, pueden ser necesarias otras técnicas de detoxificación.
Esta etapa es crítica.
Si el desinfectante siguiera actuando después de finalizar oficialmente el tiempo de contacto, la reducción viral obtenida podría sobreestimarse.
5. Determinación De La Infectividad Viral Residual
A continuación se determina cuánto virus infeccioso permanece después del tratamiento.
EN 14675 contempla métodos basados en cultivo celular, entre ellos:
- Determinación de TCID₅₀.
- Ensayos cuantales mediante observación del efecto citopático.
- Plaque assay o ensayo de formación de placas.
El título viral obtenido después del tratamiento se compara con el control correspondiente para calcular la reducción logarítmica producida por el desinfectante.
TCID₅₀, Efecto Citopático Y Plaque Assay
La evaluación de actividad viricida es diferente de un ensayo bactericida convencional.
Los virus no forman colonias en un medio microbiológico de la misma manera que una bacteria.
Para detectar su infectividad es necesario utilizar cultivos celulares susceptibles al virus.
Uno de los parámetros utilizados por EN 14675 es el TCID₅₀ —Tissue Culture Infectious Dose 50 %—, que representa la dosis viral capaz de producir efecto citopático en el 50 % de los cultivos celulares inoculados.
La norma contempla el cálculo mediante el método de Spearman-Kärber.
Otra posibilidad es utilizar un ensayo de formación de placas, donde la infección viral genera áreas de lisis visibles en una monocapa celular.
En ambos casos, el objetivo es el mismo:
determinar la cantidad de virus infeccioso antes y después de la exposición al desinfectante.
El Criterio Clave: Una Reducción De Al Menos 4 Log
Para que un producto demuestre actividad viricida según EN 14675 debe conseguir una reducción del título viral de al menos:
4 log₁₀
Esto equivale a reducir el título de virus infeccioso por un factor de al menos 10.000 respecto al control correspondiente.
Pero alcanzar matemáticamente este valor no es suficiente por sí solo.
El ensayo únicamente puede interpretarse si se cumplen también los criterios de validación establecidos por el método.
Los Controles Son Tan Importantes Como El Resultado
Un ensayo EN 14675 debe demostrar que el sistema experimental funciona correctamente y que el resultado observado se debe realmente a la actividad viricida del producto.
Entre los aspectos que deben controlarse se encuentran:
- Que la suspensión viral inicial permita demostrar una reducción de 4 log₁₀.
- Que el sistema de referencia presente el comportamiento esperado.
- Que la citotoxicidad del producto no impida detectar el virus residual.
- Que el tratamiento de las células no altere significativamente su susceptibilidad al virus.
- Que la actividad del desinfectante se haya detenido adecuadamente al finalizar el tiempo de contacto.
- Que exista al menos una concentración capaz de alcanzar una reducción igual o superior a 4 log₁₀.
- Que también exista al menos una concentración que proporcione una reducción inferior a 4 log₁₀.
Estos controles son fundamentales porque un resultado aparentemente excelente podría no ser válido si, por ejemplo, el producto destruye las células utilizadas para detectar el virus.
En ese caso, la ausencia de efecto citopático podría confundirse con una ausencia de virus cuando en realidad el sistema de detección ha quedado comprometido.
Citotoxicidad: Uno De Los Principales Retos Del Ensayo
La citotoxicidad es uno de los aspectos técnicos más importantes en los ensayos viricidas.
El desinfectante puede afectar no solo al virus, sino también a las células utilizadas posteriormente para detectar su infectividad.
Si la concentración residual del producto daña las células, puede resultar imposible determinar correctamente si todavía existe virus viable.
Por ello, EN 14675 establece controles específicos para comprobar que la citotoxicidad no compromete la demostración de una reducción de 4 log₁₀.
Cuando la dilución por sí sola no permite reducir suficientemente la toxicidad del producto, la norma contempla técnicas adicionales de detoxificación, como procesos de separación mediante tamización molecular o ultrafiltración.
Esto demuestra por qué la evaluación viricida requiere un control metodológico especialmente cuidadoso.
EN 14675 Y La Evaluación De La Competencia Del Laboratorio
Aplicar correctamente EN 14675 implica controlar numerosas variables:
- Preparación y conservación del virus.
- Cultivo celular.
- Título de la suspensión viral.
- Concentraciones del producto.
- Preparación de sustancias interferentes.
- Tiempo de contacto.
- Supresión de la actividad del desinfectante.
- Titulación viral.
- Cálculo de la reducción logarítmica.
Cada una de estas etapas puede introducir variabilidad.
Por eso, dos laboratorios que aparentemente aplican la misma norma pueden obtener resultados diferentes si existen desviaciones en alguno de estos puntos.
Los ensayos de aptitud o Proficiency Testing permiten evaluar esta competencia mediante comparaciones interlaboratorio.
Proficiency Testing Para EN 14675
En un programa PT basado en EN 14675, varios laboratorios reciben un ítem preparado bajo unas condiciones definidas y realizan la evaluación utilizando el método correspondiente.
Posteriormente, los resultados se comparan para obtener información sobre el desempeño de cada participante.
Este tipo de ejercicio permite detectar:
- Desviaciones sistemáticas.
- Problemas relacionados con la titulación viral.
- Diferencias en la preparación del ensayo.
- Problemas de interpretación.
- Errores en la expresión de los resultados.
- Posibles áreas de mejora del procedimiento interno.
La evaluación estadística de los resultados de un esquema PT debe realizarse siguiendo procedimientos técnicamente justificados. La ISO 13528 y la revisión inicial de los resultados de los ensayos de aptitud proporcionan un marco especialmente relevante para analizar los datos antes de calcular las estadísticas de desempeño.
El Programa EN 14675 De SHAPYPRO
SAHPYPRO organiza programas de Proficiency Testing para la evaluación de actividad viricida según EN 14675, dirigidos a laboratorios que realizan ensayos de eficacia de antisépticos y desinfectantes químicos.
El programa figura en la base de datos internacional EPTIS como esquema EN 14675:2015 de SAHPYPRO.
El esquema utiliza como propiedad evaluada la actividad viricida de antisépticos y desinfectantes químicos utilizados en el área veterinaria, con Bovine enterovirus Type 1 como organismo de referencia.
La participación en estos programas permite al laboratorio disponer de una evaluación externa de su desempeño y puede aportar información útil para:
- Mantener el control de la calidad del método.
- Detectar tendencias o desviaciones.
- Investigar resultados no satisfactorios.
- Demostrar competencia técnica.
- Apoyar los requisitos asociados a sistemas de acreditación y calidad.
Los laboratorios interesados pueden consultar los próximos Proficiency Testing Programs de SAHPYPRO para revisar las convocatorias disponibles.
EN 14675 No Es Solo Obtener Un Resultado ≥ 4 Log
Uno de los principales errores al interpretar un ensayo viricida es reducir todo el método a una única cifra.
EN 14675 no consiste únicamente en comprobar si el producto alcanza 4 log₁₀.
Para que esa reducción tenga significado, el laboratorio debe demostrar que:
- El sistema viral era adecuado.
- El ensayo era suficientemente sensible.
- La citotoxicidad estaba controlada.
- La actividad residual del desinfectante se detuvo correctamente.
- Los controles cumplieron los criterios establecidos.
- Las condiciones ensayadas corresponden con la utilización que se quiere respaldar.
La reducción logarítmica es el resultado final de un proceso experimental mucho más amplio.
Por eso, la competencia técnica del laboratorio tiene un papel fundamental en la fiabilidad de la conclusión.
Conclusión
La EN 14675 establece un método de fase 2, etapa 1 para evaluar la actividad viricida de antisépticos y desinfectantes químicos utilizados en el área veterinaria.
El ensayo utiliza Bovine enterovirus Type 1 (ECBO) como virus de referencia y combina condiciones controladas de temperatura, tiempo de contacto, concentración y carga orgánica para determinar la reducción del título viral conseguida por el producto.
Para demostrar actividad viricida debe alcanzarse una reducción de al menos 4 log₁₀, pero el resultado solo es válido cuando los controles de citotoxicidad, infectividad, inactivación y supresión de la actividad del producto cumplen los criterios establecidos.
Por tanto, aplicar EN 14675 correctamente requiere mucho más que seguir una secuencia de pasos.
Requiere controlar un sistema experimental complejo en el que cultivo celular, preparación viral, condiciones de ensayo, controles y cálculo de resultados deben funcionar de manera coherente.
En este contexto, los programas de Proficiency Testing de SAHPYPRO ofrecen a los laboratorios una herramienta para comparar su desempeño, identificar posibles desviaciones y reforzar la confianza en la aplicación del método.