La EN 1656 establece un método cuantitativo de suspensión para evaluar la actividad bactericida de antisépticos y desinfectantes químicos utilizados en el área veterinaria. El ensayo permite determinar si un producto alcanza la reducción bacteriana requerida bajo condiciones controladas de concentración, temperatura, tiempo de contacto y presencia de sustancias interferentes.
La eficacia de un desinfectante no depende únicamente de su composición. Un mismo producto puede presentar resultados diferentes en función de la concentración utilizada, la temperatura, el tiempo durante el que permanece en contacto con los microorganismos o la cantidad de materia orgánica presente.
Por este motivo, EN 1656 establece unas condiciones normalizadas que permiten evaluar y comparar el comportamiento bactericida de los productos de forma reproducible.
La norma corresponde a un ensayo de fase 2, etapa 1, es decir, un ensayo cuantitativo de suspensión diseñado para estudiar la actividad del producto teniendo en cuenta determinadas condiciones relacionadas con su utilización práctica.
¿Qué Es La Norma EN 1656?
La EN 1656:2019, adoptada en España como UNE-EN 1656:2020, establece los requisitos mínimos y el método de ensayo para determinar la actividad bactericida de antisépticos y desinfectantes químicos utilizados en el ámbito veterinario.
La versión actual sustituye a EN 1656:2009 y fue revisada, entre otros aspectos, para armonizar su estructura y redacción con otros ensayos cuantitativos de suspensión desarrollados por CEN/TC 216.
El método está diseñado para productos que formen una preparación físicamente homogénea y estable cuando se diluyen con agua dura o, en el caso de productos listos para usar, con agua.
Además, la concentración máxima que puede evaluarse mediante el método es del 80 %, ya que durante el propio procedimiento se produce una dilución al añadir la suspensión bacteriana y la sustancia interferente.
¿A Qué Productos Se Aplica EN 1656?
La EN 1656 se centra específicamente en productos utilizados dentro del área veterinaria.
Entre sus aplicaciones se incluyen:
- Desinfección de equipos mediante inmersión.
- Desinfección de superficies mediante frotamiento.
- Aplicación mediante pulverización o aerosolización.
- Desinfección mediante anegamiento u otros procedimientos.
- Desinfección de pezones antes o después del ordeño.
El campo veterinario considerado por la norma comprende actividades como la reproducción, cría, explotación ganadera, instalaciones de atención veterinaria, transporte y eliminación de animales.
Sin embargo, el método no se aplica a la cadena alimentaria una vez que los animales han sido sacrificados y han entrado en la industria de transformación.
Tampoco es un método destinado a evaluar productos para la higiene de las manos. Para seleccionar las normas apropiadas según el uso previsto del desinfectante o antiséptico debe considerarse el marco establecido por EN 14885.
EN 1656 Es Un Ensayo De Fase 2, Etapa 1
Entender este concepto ayuda a interpretar correctamente qué demuestra el resultado.
Un ensayo de fase 2, etapa 1 se realiza en suspensión y bajo condiciones de laboratorio cuidadosamente controladas.
Por tanto, el microorganismo está suspendido en un medio líquido junto con una sustancia que simula determinadas condiciones de uso y posteriormente entra en contacto con el producto.
El ensayo permite determinar la actividad intrínseca del producto bajo las condiciones seleccionadas.
Sin embargo, no reproduce por sí solo todas las variables presentes en una superficie, equipo o instalación real.
Por ello, dentro de una estrategia completa de evaluación de eficacia, EN 1656 debe interpretarse de acuerdo con el uso previsto del producto y junto con las demás normas aplicables.
¿Qué Reducción Exige EN 1656?
El requisito fundamental es claro:
el producto debe demostrar una reducción bacteriana de al menos 5 log.
Una reducción de 5 log equivale a reducir la población bacteriana en un factor de 100 000, es decir, aproximadamente un 99,999 %.
La reducción se calcula comparando el número inicial de microorganismos presentes al comenzar el tiempo de contacto con el número de bacterias supervivientes después de la exposición al producto.
De forma simplificada:
Reducción logarítmica = log N₀ − log Nₐ
donde:
- N₀ representa la concentración bacteriana al inicio del tiempo de contacto.
- Nₐ representa el número de bacterias supervivientes después del tratamiento.
Para considerar una concentración como bactericida bajo las condiciones ensayadas, debe obtenerse una reducción igual o superior a 5 log.
Microorganismos De Ensayo Según EN 1656
Los microorganismos utilizados dependen de la aplicación prevista del producto.
Desinfección General En El Área Veterinaria
Para productos destinados a la desinfección general, la norma establece como microorganismos mínimos:
- Enterococcus hirae ATCC 10541.
- Proteus hauseri ATCC 13315.
- Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442.
- Staphylococcus aureus ATCC 6538.
Proteus hauseri aparecía anteriormente identificado como Proteus vulgaris.
Desinfectantes De Pezones
Para productos destinados específicamente a la desinfección de pezones se utilizan:
- Escherichia coli ATCC 10536.
- Staphylococcus aureus ATCC 6538.
- Streptococcus uberis ATCC 19436.
Además, pueden incluirse microorganismos adicionales cuando sean relevantes para las condiciones específicas de utilización del producto.
Esta diferenciación resulta importante porque la norma no evalúa todos los desinfectantes veterinarios mediante un único conjunto de microorganismos.
Condiciones De Ensayo De EN 1656
Uno de los aspectos más relevantes de la EN 1656 es que una reducción de 5 log no puede interpretarse de forma aislada.
El resultado siempre está asociado a unas condiciones experimentales concretas.
Entre las principales variables se encuentran:
- Concentración del producto.
- Temperatura.
- Tiempo de contacto.
- Microorganismo.
- Sustancia interferente.
- Condición de suciedad simulada.
Por tanto, afirmar únicamente que un producto “cumple EN 1656” aporta menos información que indicar a qué concentración, temperatura, tiempo de contacto y condiciones ha demostrado actividad bactericida.
Temperatura Y Tiempo De Contacto
Para productos destinados a la desinfección de superficies en el área veterinaria, la norma permite evaluar temperaturas comprendidas entre 5 °C y 40 °C, en intervalos de 5 °C.
El tiempo de contacto puede seleccionarse en función del uso previsto, dentro de los límites establecidos por el método:
- Mínimo: 1 minuto.
- Máximo: 120 minutos.
Para la desinfección de pezones se aplican condiciones diferentes.
Después Del Ordeño
El tiempo de contacto puede encontrarse entre:
- Mínimo: 1 minuto.
- Máximo: 30 minutos.
Antes Del Ordeño
Los tiempos son más cortos:
- Mínimo: 30 segundos.
- Máximo: 3 minutos.
Además, para los desinfectantes de pezones las temperaturas establecidas se encuentran entre 20 °C y 30 °C.
Estas diferencias permiten adaptar el ensayo a situaciones de uso veterinario distintas.
La Materia Orgánica Puede Cambiar La Eficacia De Un Desinfectante
En condiciones reales, los desinfectantes rara vez actúan sobre una superficie completamente limpia.
Proteínas, restos orgánicos, secreciones u otros materiales pueden reducir la disponibilidad de determinadas sustancias activas y, en consecuencia, disminuir la eficacia del producto.
Para tener en cuenta esta variable, EN 1656 utiliza sustancias interferentes.
Condiciones De Suciedad De Nivel Bajo
Para la desinfección general puede utilizarse:
3,0 g/l de albúmina bovina.
Condiciones De Suciedad De Nivel Alto
La norma establece una combinación de:
10 g/l de albúmina bovina + 10 g/l de extracto de levadura.
Asimismo, pueden seleccionarse otras sustancias relevantes cuando sea necesario reproducir condiciones particulares de utilización.
Condiciones Específicas Para Desinfectantes De Pezones
En los productos destinados a la desinfección de pezones también cambia la sustancia interferente utilizada.
Antes del ordeño:
3,0 g/l de albúmina bovina.
Después del ordeño:
10,0 g/l de leche en polvo.
Esta diferenciación pretende representar mejor las condiciones a las que puede enfrentarse el desinfectante durante su utilización.
Por tanto, la evaluación de un producto destinado específicamente a esta aplicación debe realizarse teniendo en cuenta estas particularidades.
¿Cómo Se Realiza El Ensayo EN 1656?
El principio del método puede resumirse en varias etapas.
- Preparación De La Suspensión Bacteriana
Se prepara una suspensión estandarizada del microorganismo correspondiente.
La suspensión de ensayo debe contener inicialmente entre:
1,5 × 10⁸ y 5 × 10⁸ UFC/ml.
Además, se prepara independientemente una suspensión de validación utilizada para comprobar que el método funciona correctamente.
- Adición De La Sustancia Interferente
La suspensión bacteriana se mezcla con la sustancia interferente correspondiente a las condiciones que se desean simular.
Esta mezcla se mantiene durante un periodo previo de 2 minutos antes de añadir el desinfectante.
- Exposición Al Producto
Posteriormente se incorpora la solución del producto a la concentración seleccionada.
La mezcla se mantiene a la temperatura establecida durante el tiempo de contacto definido.
- Detención De La Actividad Del Desinfectante
Una vez finalizado el tiempo de contacto, la actividad bactericida debe detenerse inmediatamente.
El método preferente de EN 1656 es la dilución-neutralización.
Si no puede encontrarse un neutralizante adecuado, puede utilizarse como alternativa la filtración sobre membrana.
- Recuento De Las Bacterias Supervivientes
Después de neutralizar o eliminar la actividad residual del producto, se realiza el recuento de las bacterias supervivientes.
Finalmente, el resultado se compara con la población inicial para calcular la reducción logarítmica alcanzada.
La Neutralización Es Esencial Para Obtener Un Resultado Válido
Neutralizar correctamente el desinfectante es una parte crítica del ensayo.
Si la actividad del producto continúa después de finalizar el tiempo de contacto, las bacterias pueden seguir siendo inactivadas durante la preparación y el recuento.
En ese caso, el resultado podría indicar una eficacia superior a la que realmente se produjo durante el tiempo de contacto establecido.
Por este motivo, EN 1656 exige validar la neutralización para:
- El producto evaluado.
- La concentración más alta utilizada.
- Cada microorganismo.
- Cada condición experimental seleccionada.
Además, el neutralizante no debe ejercer por sí mismo una acción tóxica significativa sobre las bacterias.
La norma incorpora controles específicos para demostrar tanto la ausencia de efectos negativos del neutralizante como la eficacia del procedimiento empleado.
Dilución-Neutralización O Filtración Sobre Membrana
La norma establece como método preferente la dilución-neutralización.
En este procedimiento, una vez terminado el tiempo de contacto, una alícuota de la mezcla se transfiere inmediatamente a un neutralizante capaz de detener la actividad antimicrobiana residual.
Sin embargo, no todos los productos pueden neutralizarse adecuadamente mediante este procedimiento.
Cuando no es posible encontrar un neutralizante válido, puede utilizarse el método de filtración sobre membrana.
En este caso, las bacterias se retienen en una membrana de 0,45 μm y el producto se elimina mediante un procedimiento de aclarado validado.
Independientemente del método utilizado, debe demostrarse que el procedimiento permite recuperar correctamente los microorganismos supervivientes.
La Importancia De Los Controles Y La Validación
Un resultado de reducción ≥ 5 log no es suficiente por sí solo para considerar válido el ensayo.
EN 1656 incorpora controles destinados a demostrar que las condiciones experimentales y el propio procedimiento analítico no distorsionan el resultado.
Entre ellos se encuentran:
Control A — Condiciones Experimentales
Comprueba que las condiciones utilizadas no provocan por sí mismas una reducción significativa de la población bacteriana.
Control B — Neutralizador O Filtración
Permite verificar que el neutralizador o el procedimiento de filtración no perjudican la recuperación de los microorganismos.
Control C — Validación Del Método
Demuestra que el sistema utilizado consigue detener o eliminar adecuadamente la actividad antimicrobiana del producto.
Solo cuando se cumplen los requisitos establecidos para estos controles puede considerarse válido el ensayo.
No Basta Con Ensayar Una Única Concentración
Otro aspecto interesante de EN 1656 es que las soluciones del producto deben prepararse, como mínimo, a tres concentraciones diferentes.
El objetivo es incluir tanto:
- Una concentración situada en el rango activo.
- Como una concentración situada en el rango no activo.
De hecho, para que el ensayo permita determinar adecuadamente la actividad del producto, al menos una concentración debe alcanzar una reducción ≥ 5 log y al menos otra debe presentar una reducción < 5 log.
Esto permite identificar con mayor precisión la concentración bactericida del producto bajo las condiciones seleccionadas.
¿Qué Es El Microorganismo Limitante?
No todas las bacterias presentan necesariamente la misma sensibilidad frente a un desinfectante.
Por ello, EN 1656 determina para cada microorganismo la concentración más baja del producto capaz de alcanzar una reducción de al menos 5 log.
El microorganismo limitante es aquel que necesita la mayor concentración para conseguir ese resultado.
En otras palabras, es la cepa menos susceptible al producto dentro de las condiciones ensayadas.
La concentración activa frente a este microorganismo se utiliza para establecer la concentración bactericida determinada conforme a EN 1656.
Este concepto es importante porque evita basar la conclusión únicamente en la bacteria más sensible al producto.
¿Cuándo Cumple Un Producto La EN 1656?
Para los productos destinados a la desinfección general de superficies veterinarias, el ensayo se considera satisfactorio cuando, en un ensayo válido, se demuestra una reducción ≥ 5 log frente a:
- Enterococcus hirae.
- Proteus hauseri.
- Pseudomonas aeruginosa.
- Staphylococcus aureus.
El resultado debe obtenerse para la temperatura, tiempo de contacto, concentración y sustancia interferente seleccionados.
Para los desinfectantes de pezones, el mismo requisito de reducción mínima debe demostrarse frente a:
- Escherichia coli.
- Staphylococcus aureus.
- Streptococcus uberis.
Además, deben aplicarse las condiciones correspondientes al uso antes o después del ordeño.
Por tanto, el resultado final debería expresar claramente bajo qué condiciones el producto demuestra actividad bactericida.
EN 1656 Y Los Ensayos De Aptitud
Aplicar correctamente un método normalizado no depende únicamente de disponer del documento técnico.
La preparación de las suspensiones, el control de las concentraciones bacterianas, la elección y validación del neutralizante, el cumplimiento exacto de los tiempos de contacto y el recuento microbiológico pueden introducir variabilidad entre laboratorios.
Por este motivo, los Proficiency Testing Programs (PT) permiten comparar el desempeño de diferentes laboratorios que aplican un mismo método.
La participación en ensayos de aptitud puede ayudar a:
- Evaluar el desempeño técnico del laboratorio.
- Comparar resultados con otros participantes.
- Detectar desviaciones metodológicas.
- Identificar posibles problemas sistemáticos.
- Aportar evidencia objetiva sobre la validez de los resultados.
- Reforzar los procesos de mejora continua.
La EN 1656 establece cómo debe ejecutarse el ensayo bactericida; los programas PT permiten evaluar cómo está aplicando ese método cada laboratorio.
Esta diferencia es importante para no confundir el objetivo de la norma con el de una comparación interlaboratorio.
Si tu laboratorio participa en ensayos relacionados con desinfectantes y antisépticos, puedes consultar los próximos Proficiency Testing Programs de SAHPYPRO y revisar las fechas disponibles para inscribirte: https://shapypro.com/es/proximos-programas-ensayos-aptitud/
EN 1656 Y EN 14885: Cómo Se Relacionan
EN 14885 proporciona el marco general para seleccionar y aplicar las normas europeas destinadas a demostrar la eficacia de antisépticos y desinfectantes químicos.
Dentro de este sistema, EN 1656 aporta un método específico para evaluar la actividad bactericida en el área veterinaria mediante un ensayo cuantitativo de suspensión de fase 2, etapa 1.
Por tanto, la selección del conjunto de ensayos necesario para respaldar las reivindicaciones de eficacia de un producto debe realizarse teniendo en cuenta:
- El área de aplicación.
- El uso previsto.
- Los microorganismos frente a los que se reivindica actividad.
- El método de aplicación.
- Las condiciones reales de utilización.
Así, EN 1656 forma parte de una estrategia de evaluación más amplia y no debería interpretarse de forma aislada.
Ensayos EN 1656 Con SHAPYPRO
En SHAPYPRO, desarrollamos Proficiency Testing Programs relacionados con métodos normalizados para evaluar la eficacia de antisépticos y desinfectantes químicos.
Los intercomparativos permiten a los laboratorios evaluar su desempeño en aspectos críticos de métodos como EN 1656 y comparar sus resultados con los obtenidos por otros participantes.
Además, este tipo de programas aporta información objetiva que puede utilizarse dentro de los sistemas de gestión de calidad y en los procesos de mejora continua del laboratorio.
La correcta aplicación de EN 1656 requiere controlar numerosas variables experimentales. Precisamente por ello, comprobar el desempeño mediante comparaciones interlaboratorio constituye una herramienta especialmente útil para los laboratorios que trabajan en evaluación de eficacia de desinfectantes.
Conclusión
La EN 1656 establece un método estandarizado para evaluar la actividad bactericida de antisépticos y desinfectantes químicos utilizados en el área veterinaria.
El criterio de reducción mínima de 5 log es uno de sus elementos esenciales, pero no es el único.
Microorganismos, concentración, temperatura, tiempo de contacto, sustancias interferentes, neutralización y controles de validación forman parte del resultado y deben interpretarse conjuntamente.
Asimismo, la distinción entre productos destinados a la desinfección general y productos para la desinfección de pezones permite adaptar las condiciones experimentales a diferentes aplicaciones veterinarias.
Aplicar correctamente todos estos parámetros permite obtener resultados reproducibles y comparables. Además, la participación en Proficiency Testing Programs puede ayudar a los laboratorios a verificar su desempeño y detectar posibles desviaciones en la aplicación del método.